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投文章wb必須要三次結(jié)果嗎

發(fā)布時(shí)間：2023-05-24 19:05:02 稿源：創(chuàng)意嶺閱讀： 70

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wb實(shí)驗(yàn)的原理和步驟
WB三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果如何分析，三組除以內(nèi)參的后的結(jié)果組間趨勢(shì)一致，但是三組數(shù)據(jù)差別太大，

投文章wb必須要三次結(jié)果嗎

wb實(shí)驗(yàn)的原理和步驟

WB實(shí)驗(yàn)是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質(zhì)樣品分離后，利用特殊虹吸或電場(chǎng)裝置印跡至固相介質(zhì)（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原。

與相對(duì)應(yīng)的第一抗體特異性結(jié)合，之后再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體相結(jié)合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測(cè)特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。

蛋白質(zhì)樣品制備

原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

1.培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。

2.棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。

3.加入1X SDS樣品緩沖液，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。

4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5.煮沸樣品5min。

6.離心12000g，5min，取上清。

SDS-PAGE電泳

一、清洗玻璃板

二、灌膠與上樣

1. 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。

2. 配 10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。

3. 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

4. 配 4％的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

5. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。

6. 在電泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液，上樣。

7. 連接電泳槽到電泳儀。上槽接負(fù)極,下槽接正極，通電起始電壓70～ 80V，10min后100V，電泳2h或當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至離底部1cm時(shí)，停止電泳。

轉(zhuǎn)膜

1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。注意：若檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。

2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。

3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治:海綿3層濾紙膠膜，3層濾紙海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記:膠放于負(fù)極面(黑色面)。

4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面對(duì)黑色面)，加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h(電流約為 0.3A)。

5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。

封閉與雜交

1.用25ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。

2.置膜于25ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng)。

3.15mlTBS/T洗3次(5min/T)。

4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動(dòng)。

5.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。

7.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

8.15ml TBS洗1次。5

顯色

將 A、B 發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。

取出膠片立即完全浸入顯影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。

WB 中常見的問題以及處理辦法。

一、信號(hào)強(qiáng)度低

信號(hào)強(qiáng)度低是指在正常曝光條件下得到的目的條帶微小或是沒有目的條帶，而增加曝光時(shí)間又會(huì)招致背景高、雜帶多等問題。掃除試劑質(zhì)量、操作失誤等方面的影響，這一類問題產(chǎn)生的主要緣由如下：

① 樣本蛋白表達(dá)量缺乏。倡議添加蛋白表達(dá)量較高的細(xì)胞系作為陽性對(duì)照，或是恰當(dāng)增加上樣量以取得較高程度的信號(hào)；

② 蛋白質(zhì)降解。在蛋白樣品制備期間留意蛋白酶抑止劑 PMSF 的運(yùn)用，所制備的樣品盡快檢測(cè)或妥善保管；

③ 蛋白的轉(zhuǎn)膜。運(yùn)用恰當(dāng)孔徑的膜，同時(shí)優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時(shí)間，關(guān)于高分子量蛋白可能需求更長(zhǎng)的轉(zhuǎn)膜時(shí)間。

④ 抗體的運(yùn)用?？贵w的反響種屬與實(shí)驗(yàn)類型需求可以滿足實(shí)驗(yàn)的需求，此外，抗體的稀釋比、孵育時(shí)間等問題也需求在實(shí)驗(yàn)中不時(shí)優(yōu)化；

⑤ 蛋白與抗體分離率低。減少洗膜次數(shù)或縮短洗膜時(shí)間，降低洗膜液中 NaCl 濃度等；

⑥ 抗原被封鎖液遮蓋。換用不同的封鎖液，優(yōu)化封鎖液中蛋白質(zhì)濃度并縮短封鎖時(shí)間；

⑦ 甲醇濃渡過高。會(huì)招致蛋白質(zhì)與 SDS 別離，并沉淀在凝膠中，同時(shí)使凝膠收縮或變硬，從而抑止高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中可恰當(dāng)降低甲醇濃度或者運(yùn)用乙醇、異丙醇替代。

二、非特異性條帶或條帶位置不對(duì)

WB 結(jié)果中目的條帶之外的條帶被稱為非特異性條帶，有時(shí)非特異性條帶很明顯，卻沒有目的條帶，這些狀況對(duì)結(jié)果剖析會(huì)產(chǎn)生很大的干擾。普通來說惹起這類問題的主要要素有：

① 抗體的非特異性分離。通常以為，多抗的特異性不如單抗，更容易產(chǎn)生非特異性條帶，而恰當(dāng)降低抗體的濃度有助于減少雜帶。同時(shí)為了掃除二抗非特異性分離的可能，倡議設(shè)二抗陰性對(duì)照；

② 樣品蛋白量過高。恰當(dāng)降低上樣量，同時(shí)延長(zhǎng)洗濯時(shí)間與封鎖時(shí)間可防止蛋白量過高對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不良影響；

③ 蛋白質(zhì)降解。會(huì)招致條帶位置變化并產(chǎn)生更多雜帶，倡議采用新穎制備的或是凍融次數(shù)較少的樣品；

④ 細(xì)胞傳代次數(shù)過多。會(huì)招致蛋白表達(dá)形式的分化，倡議運(yùn)用原始或傳代少的細(xì)胞株；

⑤ 蛋白存在復(fù)合物。有的目的蛋白會(huì)和其他蛋白分離構(gòu)成復(fù)合物，招致條帶位置改動(dòng)，需求查閱相關(guān)文獻(xiàn)來肯定蛋白能否會(huì)構(gòu)成穩(wěn)定復(fù)合物；

⑥ 蛋白存在剪接體或多種修飾方式。局部蛋白存在剪切位點(diǎn)，有的剪切體具有免疫活性，在 WB 中也會(huì)被檢測(cè)出。此外有的目的蛋白會(huì)存在糖基化位點(diǎn)或其他修飾位點(diǎn)，條帶大小可能會(huì)遠(yuǎn)超理論分子量。因而需求查閱文獻(xiàn)或是 uniprot 來得知蛋白的剪切體大小以及修飾位點(diǎn)等。

三、背景過高

在局部 WB 結(jié)果中，條帶之外本應(yīng)是空白的背景也會(huì)有較深的顏色，對(duì)剖析結(jié)果會(huì)產(chǎn)生干擾，而且結(jié)果圖不美觀，難以用于文章發(fā)表。這種問題的可能緣由有以下幾點(diǎn)：

① 封鎖不充沛。背景過高的主要緣由之一是封鎖有問題，倡議運(yùn)用適宜的封鎖劑（脫脂奶粉、BSA 等），優(yōu)化反響濃度與封鎖時(shí)間，同時(shí)留意防止呈現(xiàn)抗體與封鎖劑的穿插反響，以及封鎖劑與含有目的抗原，內(nèi)源性生物素或者與抗生物素蛋白/鏈霉親和素不相溶等問題；

② 洗膜不充沛。恰當(dāng)增加洗膜次數(shù)弛緩沖液體積，進(jìn)步吐溫20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的問題；

③ 抗體的運(yùn)用。一抗?jié)舛蛇^高是高背景的緣由之一，且二抗也存在與封鎖劑非特異性分離的可能，因而倡議恰當(dāng)優(yōu)化一抗?jié)舛?，并設(shè)二抗陰性對(duì)照；

④ 曝光時(shí)間長(zhǎng)。倡議在實(shí)驗(yàn)中采用適宜的曝光時(shí)間。

四、條帶彌散或外形怪異

有時(shí) WB 結(jié)果圖中條帶位置契合預(yù)期，但卻由于條帶彌散、外形怪異等要素招致無法運(yùn)用，呈現(xiàn)這種狀況多半是制膠或電泳過程出了問題，詳細(xì)如下：

① 電泳時(shí)電壓、電流過高。會(huì)招致條帶遷移速率過快以及 SDS-PAGE 溫度升高，并可能使得條帶彌散、外形變形。倡議運(yùn)用適宜的電泳條件并堅(jiān)持低溫；

② 電極不均衡。會(huì)招致條帶偏斜，上樣時(shí)在無樣品的膠孔中參加等量樣品緩沖液可防止這種狀況；

③ 上樣量過高，樣品中鹽離子濃度較大。上樣量過高可能會(huì)招致條帶彌散，樣品中的鹽離子濃度不分歧則會(huì)招致條帶不齊等問題。因而在上樣時(shí)需保證樣品量分歧且恰當(dāng)，并堅(jiān)持相同的、較低的鹽離子濃度。

④ 制膠問題。在配膠時(shí)一定要保證充沛混勻，平均凝膠，上樣前用針頭將膠孔撥正并吹出膠孔中的氣泡。

⑤ 電泳緩沖液寄存過久。電泳實(shí)驗(yàn)中的緩沖液假如放置過久也會(huì)對(duì)結(jié)果有不良影響，因而倡議及時(shí)改換新的緩沖液。

五、膜上分布不平均的污點(diǎn)

有時(shí)在 WB 做出結(jié)果后，除了目的條帶以外，膜上還散布著不規(guī)律的污點(diǎn)，對(duì)結(jié)果也會(huì)有較大的干擾。這類問題產(chǎn)生的主要緣由有以下幾點(diǎn)：