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掃描電子顯微鏡樣品制備

發(fā)布時(shí)間：2023-04-19 01:37:01 稿源：創(chuàng)意嶺閱讀： 98

大家好！今天讓創(chuàng)意嶺的小編來大家介紹下關(guān)于掃描電子顯微鏡樣品制備的問題，以下是小編對(duì)此問題的歸納整理，讓我們一起來看看吧。

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本文目錄:

1、用掃描電子顯微鏡進(jìn)行形貌分析有哪些特點(diǎn)
2、掃描電鏡
3、FTIR和SEM是什么?
4、透射電子顯微鏡的樣品制作要求有哪些

掃描電子顯微鏡樣品制備

一、用掃描電子顯微鏡進(jìn)行形貌分析有哪些特點(diǎn)

放大倍率大。。高達(dá)幾十萬倍。。

分辨率高。。幾個(gè)nm

景深大

成本高

樣品可能需要前處理

操作較復(fù)雜

以下抄來的：

和光學(xué)顯微鏡及透射電鏡相比，掃描電鏡SEM（Scanning Electron Microscope）具有以下特點(diǎn)：

(一) 能夠直接觀察樣品表面的結(jié)構(gòu)，樣品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。

(二) 樣品制備過程簡(jiǎn)單，不用切成薄片。

(三) 樣品可以在樣品室中作三度空間的平移和旋轉(zhuǎn)，因此，可以從各種角度對(duì)樣品進(jìn)行觀察。　

(四) 景深大，圖象富有立體感。掃描電鏡的景深較光學(xué)顯微鏡大幾百倍，比透射電鏡大幾十倍。

(五) 圖象的放大范圍廣，分辨率也比較高?？煞糯笫畮妆兜綆资f倍，它基本上包括了從放大鏡、光學(xué)顯微鏡直到透射電鏡的放大范圍。分辨率介于光學(xué)顯微鏡與透射電鏡之間，可達(dá)3nm。

(六) 電子束對(duì)樣品的損傷與污染程度較小。

(七) 在觀察形貌的同時(shí)，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號(hào)作微區(qū)成分分析。

二、掃描電鏡

掃描電子顯微鏡(SEM)是1965年以后才迅速發(fā)展起來的新型電子儀器。其主要特點(diǎn)可歸納為：①儀器分辨率高；②儀器的放大倍數(shù)范圍大，一般可達(dá)15～180000倍，并在此范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)；③圖像景深大，富有立體感；④樣品制備簡(jiǎn)單，可不破壞樣品；⑤在SEM上裝上必要的專用附件——能譜儀(EDX)，以實(shí)現(xiàn)一機(jī)多用，在觀察形貌像的同時(shí)，還可對(duì)樣品的微區(qū)進(jìn)行成分分析。

一、掃描電子顯微鏡(SEM)的基本結(jié)構(gòu)及原理

掃描電鏡基本上是由電子光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)接收處理顯示系統(tǒng)、供電系統(tǒng)、真空系統(tǒng)等四部分組成。圖13-2-1是它的前兩部分結(jié)構(gòu)原理方框圖。電子光學(xué)部分只有起聚焦作用的匯聚透鏡，它們的作用是用信號(hào)收受處理顯示系統(tǒng)來完成的。

掃描電子顯微鏡樣品制備

圖13-2-1 SEM的基本結(jié)構(gòu)示意圖

在掃描電鏡中，電子槍發(fā)射出來的電子束，經(jīng)3個(gè)電磁透鏡聚焦，成直徑為20 μm～25 Å的電子束。置于末級(jí)透鏡上部的掃描線圈能使電子束在試樣表面上做光柵狀掃描。試樣在電子束作用下，激發(fā)出各種信號(hào)，信號(hào)的強(qiáng)度取決于試樣表面的形貌、受激區(qū)域的成分和晶體取向。試樣附近的探測(cè)器把激發(fā)出的電子信號(hào)接受下來，經(jīng)信號(hào)處理放大系統(tǒng)后，輸送到陰極射線管(顯像管)的柵極以調(diào)制顯像管的亮度。由于顯像管中的電子束和鏡筒中的電子束是同步掃描的，顯像管亮度是由試樣激發(fā)出的電子信號(hào)強(qiáng)度來調(diào)制的，由試樣表面任一點(diǎn)所收集來的信號(hào)強(qiáng)度與顯像管屏上相應(yīng)點(diǎn)亮度一一對(duì)應(yīng)，因此試樣狀態(tài)不同，相應(yīng)的亮度也必然不同。由此，得到的像一定是試樣形貌的反映。若在試樣斜上方安置的波譜儀和能譜儀，收集特征X射線的波長(zhǎng)和能量，則可做成分分析。

值得注意的是，入射電子束在試樣表面上是逐點(diǎn)掃描的，像是逐點(diǎn)記錄的，因此試樣各點(diǎn)所激發(fā)出來的各種信號(hào)都可選錄出來，并可同時(shí)在相鄰的幾個(gè)顯像管上或X—Y記錄儀上顯示出來，這給試樣綜合分析帶來極大的方便。

二、高能電子束與樣品的相互作用

并從樣品中激發(fā)出各種信息。對(duì)于寶石工作者，最常用的是二次電子、背散射電子和特征X射線。上述信息產(chǎn)生的機(jī)理各異，采用不同的檢測(cè)器，選擇性地接收某一信息就能對(duì)樣品進(jìn)行成分分析(特征X射線)或形貌觀察(二次電子和背散射電子)。這些信息主要有以下的特征：

1.二次電子(SE)

從距樣品表面100 Å左右的深度范圍內(nèi)激發(fā)的低能量電子(一般為0～50 eV左右)發(fā)生非彈性碰撞。二次電子像是SEM中應(yīng)用最廣、分辨率最高的一種圖像，成像原理亦有一定的代表性。高能入射電子束(一般為10～35 keV)由掃描線圈磁場(chǎng)的控制，在樣品表面上按一定的時(shí)間、空間順序作光柵式掃描，而從試樣中激發(fā)出二次電子。被激發(fā)出的二次電子經(jīng)二次電子收集極、閃爍體、光導(dǎo)管、光電倍增管以及視頻放大器，放大成足夠強(qiáng)的電信號(hào)，用以調(diào)制顯像管的亮度。由于入射電子束在樣品上的掃描和顯像管的電子束在熒光屏上的掃描用同一個(gè)掃描發(fā)生器調(diào)制，這就保證了樣品上任一物點(diǎn)與熒光屏上任一“像點(diǎn)”在時(shí)間與空間上一一對(duì)應(yīng)；同時(shí)，二次電子激發(fā)量隨試樣表面凹凸程度的變化而變化，所以，顯像管熒光屏上顯現(xiàn)的是一幅明暗程度不同的反映樣品表面形貌的二次電子像。由于二次電子具有低的能量，為了收集到足夠強(qiáng)的信息，二次電子檢測(cè)器的收集必須處于正電位(一般為+250 V )，在這個(gè)正電位的作用下，試樣表面向各個(gè)方向發(fā)射的二次電子都被拉向收集極(圖13-2-2a)，這就使二次電子像成為無影像，觀察起來更真實(shí)、更直觀、更有立體感。

2.背散射電子(BE)

從距樣品表面0.1～1 μm的深度范圍內(nèi)散射回來的入射電子，其能量近似等于原入射電子的能量發(fā)生彈性碰撞。背散射電子像的成像過程幾乎與二次電子像相同，只不過是采用不同的探測(cè)器接收不同的信息而已，如圖13-2-2所示。

掃描電子顯微鏡樣品制備

圖13-2-2 二次電子圖像和背散射電子圖像的照明效果

(據(jù)S.Kimoto，1972)

a：二次電子檢測(cè)方法；a′：二次電子圖像的照明效果；b：背散射電子檢測(cè)方法；b′：背散射電子圖像的照明效果

3.特征X射線

樣品中被激發(fā)了的元素特征X射線釋放出來(發(fā)射深度在0.5～5μm范圍內(nèi))。而要對(duì)樣品進(jìn)行微區(qū)的元素的成分分析，則需借助于被激發(fā)的特征X射線。這就是通常所謂的“電子探針分析”，又通常把測(cè)定特征X射線波長(zhǎng)的方法叫波長(zhǎng)色散法(WDS)；測(cè)定特征X射線能量的方法叫能量色散法(EDS)。掃描電子顯微鏡除了可運(yùn)用于寶玉石的表面形貌外，它經(jīng)常帶能譜(EDS)做成分分析。EDS主要是由高效率的鋰漂移硅半導(dǎo)體探測(cè)器、放大器、多道脈沖高度分析器和記錄系統(tǒng)組成。樣品被激發(fā)的特征X射線，入射至鋰漂移硅半導(dǎo)體探測(cè)器中，使之產(chǎn)生電子—空穴對(duì)，然后轉(zhuǎn)換成電流脈沖，放大，經(jīng)多道脈沖高度分析器按能量高低將這些脈沖分離，由這些脈沖所處的能量位置，可知試樣所含的元素的種類，由具有相應(yīng)能量的脈沖數(shù)量可知該元素的相對(duì)含量。利用此方法很容易確定寶石礦物的成分。

掃描電鏡若帶有能譜(EDS)則不但可以不破壞樣品可運(yùn)用于做寶玉石形貌像，而且還能快速做成分分析(如圖13-2-3，廖尚儀，2001)。因此它是鑒定和區(qū)別相似寶玉石礦物的好方法，如紅色的鎂鋁榴石，紅寶石、紅尖晶石、紅碧璽等，因?yàn)樗鼈兊某煞植煌淠茏V(EDS)圖也就有較大的區(qū)別。波譜(WDS)定量分析比能譜(EDS)定量分析精確，但EDS分析速度快。

圖13-2-3 藍(lán)色鉀-鈉閃石的能譜圖

三、SEM的微形貌觀察

1.樣品制備

如果選用粉狀樣，需要事先選擇好試樣臺(tái)。如果是塊狀樣，最大直徑一般不超過15mm。如果單為觀察形貌像，直徑稍大一些(39mm)仍可以使用，但試樣必須導(dǎo)電。如果是非導(dǎo)電體試樣，必須在試樣表面覆蓋一層約200 Å厚度的碳或150 Å的金。

2.SEM形貌像的獲得

掃描電子顯微鏡樣品制備

圖13-2-4 掃描電子顯微鏡下石英(a)和藍(lán)色閃石玉(b)的二次電子像

觀察試樣的形貌，常用二次電子像或背散射電子像。圖13-2-4是石英(a)和藍(lán)色閃石玉(鉀-鈉閃石b)的二次電子像。同時(shí)由于二次電子像具有較高的分辨率和較高的放大倍數(shù)，因此，比背散射電子像更為常用。而成分分析則常采用背散射電子像。

三、FTIR和SEM是什么?

FTIR是指紅外光譜儀器的第三代傅立葉變換紅外吸收光譜儀（FTIR)。SEM是1965年發(fā)明的較現(xiàn)代的細(xì)胞生物學(xué)研究工具掃描電子顯微鏡。

四、透射電子顯微鏡的樣品制作要求有哪些

①快速冷凍，用致冷劑（如液氮、液體氟利昂、液體丙烷等）或其他方法使生物材料急劇冷凍，使組織和細(xì)胞中的水只能凍結(jié)成體積極小的冰晶甚至無定形的冰──玻璃態(tài)。這樣，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不致被冰晶破壞，生物大分子可保持天然構(gòu)型，酶及抗原等能保存其生物活性，可溶性化學(xué)成分（如小分子有機(jī)物和無機(jī)離子）也不致流失或移位。用冷凍的組織塊，可進(jìn)行切片、冷凍斷裂、冷凍干燥和冷凍置換等處理。用此法固定的樣品既可提供組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)信息，又可提供相關(guān)的細(xì)胞化學(xué)信息。②化學(xué)固定，固定劑有凝聚型和非凝聚型兩種，前者如光學(xué)顯微術(shù)中常用的乙醇、二氯化汞等，此法常使大多數(shù)蛋白質(zhì)凝聚成固體,結(jié)構(gòu)發(fā)生重大變化,常導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)畸變。非凝聚型固定劑包括戊二醛、丙烯醛和甲醛等醛類固定劑和四氧化鋨，四氧化鉬等，適用于電子顯微。它們對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的交聯(lián)作用,可以穩(wěn)定大部分蛋白質(zhì)而不使之凝聚,避免了過分的結(jié)構(gòu)畸變。它們與細(xì)胞蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的化學(xué)親和力，固定處理后，固定劑成為被固定的蛋白質(zhì)的一部分。如用含有重金屬元素的固定劑四氧化鋨（也是良好的電子染色劑）進(jìn)行固定，因?yàn)殇~與蛋白質(zhì)結(jié)合，增強(qiáng)了散射電子的能力，提高了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的反差。采用一種以上固定劑的多重固定方法，如采用戊二醛和四氧化鋨的雙固定法，能較有效地減少細(xì)胞成分的損失。此外，固定劑溶液的濃度、pH及所用的緩沖劑類型、滲透壓、固定時(shí)間和溫度等對(duì)固定效果都有不同程度的影響。

固定操作方法通常是先將材料切成 1立方毫米左右小塊，浸在固定液中，保持一定溫度（通常為4℃）,進(jìn)行一定時(shí)間的固定反應(yīng)。取材操作要以盡可能快的速度進(jìn)行，以減少組織自溶作用造成的結(jié)構(gòu)破壞。對(duì)某些難以固定的特殊組織，如腦、脊髓等，最好使用血管灌注方法固定，即通過血管向組織內(nèi)灌注固定液，使固定液在組織發(fā)生缺氧癥或解剖造成損傷之前，快速而均勻地滲透到組織的所有部分。灌注固定的效果比浸沒固定好得多。

脫水化學(xué)固定后，將材料浸于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中以除去組織的游離水。為避免組織收縮，所用溶劑需從低濃度逐步提高到純有機(jī)溶劑，逐級(jí)脫水。

浸透脫水之后，用適當(dāng)?shù)臉渲瑔误w與硬化劑的混合物即包埋劑，逐步替換組織塊中的脫水劑，直至樹脂均勻地浸透到細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一切空隙中。

包埋浸透之后,將組織塊放于模具中,注入樹脂單體與硬化劑等混合物，通過加熱等方法使樹脂聚合成堅(jiān)硬的固體。用作包埋劑的樹脂有甲基丙烯酸酯、聚酯和環(huán)氧樹脂等。最廣泛使用的是某些類型的環(huán)氧樹脂，如618樹脂、Epon812、Araldite和 Spurr等商品樹脂。它們具有良好的維持樣品特性、低收縮率和較強(qiáng)的耐電子轟擊能力等優(yōu)點(diǎn)。

切片制備超薄切片要使用特制超薄切片機(jī)（大多是根據(jù)精密機(jī)械推進(jìn)或金屬熱膨脹推進(jìn)原理制成）和特殊的切片刀（用斷裂的玻璃板制成的玻璃刀或用天然金剛石研磨而成的金剛石刀）。先將樹脂包埋塊中含有生物材料的部分，用刀片在立體顯微鏡下修整成細(xì)小的金字塔形,再用超薄切片機(jī)切成厚度適中（500埃左右）的超薄片，切片應(yīng)依次相互聯(lián)接形成切片帶。切片帶漂浮于裝在切片機(jī)上的水槽中的水面上。

通過裝置在切片機(jī)上的解剖顯微鏡，監(jiān)控切片過程。用熒光燈照射水面上的切片，并根據(jù)由此產(chǎn)生的干涉光顏色來判斷切片的實(shí)際厚度（見表）。

切片通常用敷有薄的支持膜的特制金屬載網(wǎng)，從水面上撈取。快速冷凍固定的生物材料，可用冷凍超薄切片裝置制成切片。用醛類或冷凍方法固定的組織，可通過超薄切片術(shù)與生物化學(xué)技術(shù)、免疫技術(shù)等結(jié)合使用,進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)水平上的蛋白質(zhì)、核酸、酶及抗原等生物活性物質(zhì)的定位甚至定量研究。這就是電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（見細(xì)胞化學(xué)）和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。

染色電子顯微鏡主要是依賴散射電子成像，為了增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的電子反差，需要對(duì)切片進(jìn)行染色。染色是依據(jù)各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)與染色劑（重金屬鹽）結(jié)合的選擇性，而形成不同的對(duì)電子散射能力，從而產(chǎn)生借以區(qū)別各種結(jié)構(gòu)的反差。電子染色方法分塊染色和切片染色兩種：①塊染色法，在脫水劑中加入染色劑，在脫水過程中對(duì)組織塊進(jìn)行電子染色。②切片染色法，最常用，即將載有切片的金屬載網(wǎng)漂浮或浸沒在染色液中染色。也可使用有微處理機(jī)控制的染色機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化染色。一般切片染色所使用的染色劑為金屬鈾鹽和鉛鹽的雙重染色。為顯示某種特殊結(jié)構(gòu)，則可采用與該結(jié)構(gòu)有特異性結(jié)合的選擇性染色劑。

冷凍置換法用有機(jī)溶劑（如丙酮、乙醚等）在低溫條件下（通常，-80～-90℃），緩慢地置換冷凍固定的小塊組織中的冰（“惰性脫水”），這樣可減少常規(guī)方法脫水過程中有機(jī)溶劑對(duì)組織中化學(xué)組分的抽取。然后再按常規(guī)方法進(jìn)行樹脂包埋、超薄切片和染色等。用冷凍置換法，可以很好地保存快速變化過程中物質(zhì)的狀態(tài)和非常脆弱的超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)某些化學(xué)組分。

電鏡放射自顯影技術(shù)用超薄切片術(shù)與放射性同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的電鏡放射自顯影術(shù)(見同位素技術(shù))可獲得同位素標(biāo)記的化合物在組織細(xì)胞內(nèi)存在部位，以及在代謝過程中物質(zhì)的合成、分解、轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌的信息。

負(fù)染色和投影技術(shù) 研究分散的顆粒狀生物材料,為增強(qiáng)其反差，常采用的方法。

負(fù)染色研究以蛋白質(zhì)為主要成分的顆粒狀材料的最常用方法。以某些在電子束轟擊下穩(wěn)定而又不與蛋白質(zhì)相結(jié)合的重金屬鹽類作為負(fù)染色劑，使之在支持膜上將顆粒材料包圍，形成具有高電子散射能力的背景，襯托出低電子散射能力的顆粒的形態(tài)細(xì)節(jié)。其所成的電子顯微像的反差與常規(guī)電子染色相反，即暗的背景和亮的顆粒形態(tài)的所謂陰性反差。負(fù)染色方法簡(jiǎn)便，所獲得的顆粒的電子顯微圖像反差強(qiáng),分辨率也高于超薄切片,可廣泛用于研究蛋白質(zhì)分子、細(xì)菌鞭毛、蛋白質(zhì)結(jié)晶，以及生物膜及分離的細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，特別適用于蛋白質(zhì)大分子及病毒顆粒結(jié)構(gòu)的三維重建研究。常用的負(fù)染色劑有醋酸鈾、磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀、硅鎢酸、銅酸銨及甲酸鈾等。用液滴法或噴霧法將顆粒材料的懸液加在載網(wǎng)的支持膜上，然后滴加負(fù)染色劑溶液?；?qū)㈩w粒的懸液與負(fù)染色劑按一定濃度混合滴加或噴撒到支持膜上，吸去多余液體，待干燥后，即可用電鏡觀察。樣品顆粒在支持膜上的均勻分散是成功的關(guān)鍵之一。染色劑溶液的pH則是成功的另一關(guān)鍵。一般染色劑的pH應(yīng)在中性偏酸范圍（pH 5～7）,但對(duì)不同種類的顆粒材料和染色劑，最適pH也不盡相同。

投影在真空蒸發(fā)器的高真空腔中,加熱某些金屬至熔化后，金屬以細(xì)小顆粒沿直線方向蒸發(fā)出來。當(dāng)金屬微粒以一定入射角噴鍍?cè)谳d有顆粒材料的載網(wǎng)支持膜表面上時(shí),顆粒向蒸發(fā)源的一面即被鍍上一層金屬薄膜,而背蒸發(fā)源的一面及附近區(qū)域形成無金屬沉積的“陰影”，并且由于各部位散射電子能力存在著差別，這樣就能構(gòu)成具有強(qiáng)烈反差和立體感的電子顯微圖像。常用于投影的蒸發(fā)材料，有金、鉻、鉑、鈀以及鉑-銥、鉑-鈀、鉑-碳等金屬或合金。此外，還可利用電子槍投影裝置使鎢、鉭等高熔點(diǎn)金屬以極微細(xì)顆粒蒸發(fā)，從而獲得高分辨率投影。

蛋白質(zhì)展膜技術(shù)用電子顯微鏡研究核酸分子常用的方法。某些堿性球蛋白，如細(xì)胞色素c,可以在低濃度鹽溶液或蒸餾水表面展成單分子層，在展開過程中，能為蛋白質(zhì)的堿性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)所吸附的、帶負(fù)電荷的核酸分子同時(shí)展開成完整的線狀分子。然后，用帶有支持膜（有機(jī)膜或碳膜）的載網(wǎng)撈起這些蛋白質(zhì)──核酸展膜,并用染色或金屬投影法提高核酸分子的反差,可在電鏡下直接觀察核酸分子的形態(tài)、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),并可通過分子長(zhǎng)度的測(cè)量來計(jì)算核酸分子量。

冷凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)研究細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，特別是生物膜結(jié)構(gòu)的一種獨(dú)特的樣品制備技術(shù)。利用快速冷凍方法固定的生物組織塊具有剛性和脆性。在對(duì)其施加外力后，組織即在結(jié)構(gòu)上結(jié)合最薄弱的部位發(fā)生“脆性斷裂”，這就是“冷凍斷裂”。對(duì)于生物膜，斷裂沿膜內(nèi)部疏水區(qū)發(fā)生，從而暴露出膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)。利用投影和復(fù)型技術(shù)，制備斷裂面的復(fù)型,然后將組織腐蝕掉,并用載網(wǎng)撈起復(fù)型膜，就可用電鏡來研究組織斷裂表面所顯示的細(xì)胞的或生物膜內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)。在高于 10毫米汞柱真空度和-100℃溫度下，冷凍組織的斷裂表面上的冰升華為水蒸汽，而使原表面高度下降，即謂之“冰凍蝕刻”。由于組織各部分結(jié)構(gòu)的含水量不同，冰的升華造成各部分結(jié)構(gòu)的表面高度下降程度有差異，因此冰凍蝕刻的斷裂表面的投影、復(fù)型所顯示的斷裂表面形態(tài)具有很強(qiáng)的立體感。冷凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)，為細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，特別是關(guān)于細(xì)胞聯(lián)接、細(xì)胞融合、細(xì)胞分化以及生物膜的通透性的研究提供了許多重要信息。也為流行的生物膜結(jié)構(gòu)模型，即“流動(dòng)鑲嵌模型”的研究提供了有利的證據(jù)。

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